共軛焦顯微技術主要是利用針孔光圈（pinhole）將非聚焦面（on-focal plane）的光排除在外，而形成了共軛焦影像。因為在傳統的螢光顯微鏡下觀察影像時，不僅有來自聚焦面的光，非聚焦面的光也影響了影像的解析度；共軛焦顯微鏡的技術可去除傳統螢光顯微鏡影像中的迷光，可將樣品一層一層觀察，增加了影像的對比和解析度。

  

 

                                          

                                          圖：共軛焦顯微鏡原理

 

       配合全自動螢光顯微鏡和Leica LAS AF 操作軟體，共軛焦顯微鏡可進行多維影像（multi-dimentional）的觀察和影像處理。多維影像包括在同一樣品上觀察多種不同顏色的螢光強度，可同時偵測多種目標；z軸斷層掃描，依樣品的厚度指定欲掃描的上、下位置和光學切片的厚度，取得一系列不同z position的影像；時間序列掃描，觀察樣品的亮度或位置隨時間不同的變化情形；之後可將所有影像堆疊成3D影像，也可作各種角度旋轉，並輸出為連續影片播放。

  1.   共軛焦顯微影像之擷取與觀察。

  2.   多維影像之觀察：xy，xz，xt，xyz，xyt，xyzt……。

  3.   螢光樣本影像擷取觀察（共軛焦模式）。

  4.   3D影像結構重組，觀察各部分之細微結構。

  5.   細胞間反應或蛋白質折疊效果觀察與分析：：FRET。

  6.   細胞膜動力學之觀察研究：：FRAP。

  7.   Photoactive，Cage，Uncage之應用。

  8.   含活細胞培養裝置，供恆溫與CO2/O2/N2濃度調控。

 

核心設施目前有兩套共軛焦顯微系統，新式系統【Leica TCS SP5 II】與舊式系統【Leica TCS SP5】。其規格分述如下：

 

 

I. 共軛焦分光光譜掃描系統

  a.   共軛焦掃描器內可最多同時執行5組入射光(螢光)分光光譜掃描感測器(5 channel spectrophotometer detectors )。每一個螢光感測器都可獨立依據各個螢光染劑的感測光譜自行設定擷取範圍而無任何傳統濾鏡限制( filterless design )，連續感測光譜可調範圍為400 – 800 nm。本次規格掃描器內含3組感測器(PMT)及1組穿透光感測器，除同時掃描外亦可進行排序掃描( sequential scanning )。

  b.   每組螢光偵測器均使用可調控光柵控制螢光接收範圍，亦可以數值輸入設定，最小解析達1 nm。

  c.   掃描器可切換安裝使用於正立與倒立顯微鏡，無須再作任何光路與控制調整。

  d.   具自動物鏡瞳孔調控裝置(adjustable pupil illumination)，提供每顆物鏡最佳之柯式照明，以達最佳解析能力。

  e. 3組獨立的雷射光纖導光口，供紫外光雷射(或405nm)、可視光雷射與紅外光雷射同時傳導。並可同時連接8組雷射光源，完全以AOTF作為激發光波長選取與雷射強度控制，為UV(or 405 nm)-VIS-IR皆通用之共軛焦系統。

   f.   共軛焦分光光譜掃描光路俱有單一激發光孔徑及單一共軛焦感測孔徑(Pinhole)，微電腦控制，孔徑可調。

  g.   傳統掃描模式規格：
          Max. line frequency : 2800 Hz
          Min. line frequency : 1 Hz
          Max. frame rate at 512 x 512: 5 f/s
          Max. frame rate 512 x 16: 25 f/s
          Scan zoom: 1 – 40x

  h.   傳統掃描模式之解析最高可達 8192 x 8192 x 16 bits灰階影像，數位化12 bits或8 bits per channel，掃描視野大小可達中間影像對角線21 mm以上。

   i.    光學動態旋轉掃描範圍: 200度。

   j.    可對任何所選用的鏡頭自動選取紫外光(或405nm)校正孔徑稜鏡( UV correction Pinhole Lens )

  k.    可控制兩組縱深光切掃描載物檯 ( Galvanometer Z-stage及Microscope E-Stage或Microscope nosepiece )。

   l.    Galvanometer Z-stage，縱深精確度優於10 nm，再現性優於40 nm，行程450um。

 m.   所有之調控參數均可由panel box調控，且panel box具有LCD顯示功能。

 

II. 多重雷射砌合分光系統 ( Acousto Optical Beam Splitter, AOBS ) 

  a.  以超音波光學調變裝置篩選激發與釋放波長，激發波長篩選精度達2 nm，無傳統分光濾鏡組( primary dichroic mirror )

  b.  最多可同時分光八組可見光雷射激發光源。

  c.  可程式控制八組雷射激發光源之強度與分光比例。

 

III. 系統電腦及影像處理工作站 (包括 2個 19" TFT LCD顯示器 )

  a.  系統工作站Pentium4 3.0G以上CPU，2G MB以上DDR記憶體，2 組 19” LCD顯示器。

  b.  系統電路控制器，可同時操控5組感測系統。

  c.  掃描器控制設計採用 FRGA ( Field-Programmable Gate Array )。

  d.  訊號出入 ( Trigger IN / OUT )可同時操控8組感測器 ( Detectors )，12 bits解析。

  e.  系統軟體Windows XP Pro。

  f.   標準系統軟體部分( System software)：
         Continuous Scan
         Single Image Scan ( for light sensitive experiments )
         Image Series Scan
         AOTF used to minimize specimen bleaching
         Dye based pre-sets to control scans (Instrument Settings)
         Scan-Parameters are attached to image for later reconstruction.
         Unidirectional & phase corrected Bi-directional Scans
         13 scanning mode: t, xt, xλ, xyt, xyλ, xz, xzλ, xyz, xyzλ, xyt, xzt, xyzt, xytz Region of interest scan
         Excitation Multiplexing, Frame Average, Line Average

  g.  應用軟體部份( Application software)：
         Time-lapse Recording - Observation of dynamic processes by
         xt series
         xyt series
         xyzt series ( Time/Volumes series scan )
         Sequential Scan - Change of Instrument settings
         Volume by volume, Frame by frame, or Line by Line for Cross-Talk elimination
         3D projection and animation,FRAP, FREP application,Dye finder function

 

IV. 共軛焦專用全自動倒立螢光顯微鏡(可供紫外光雷射通過)

  a.  全自動倒立式螢光顯微鏡，內置共軛焦掃描專用光路控制器，可直接銜接共軛焦掃描器，且螢光模式與共軛焦掃描模式為電動切換，可由共軛焦軟體直接控制。

  b.  無線遠光學修正系統設計與光學平衡對比修正設計- Harmonic Contrast System。

  c.  採用外掛式電動控制系統，遠離電控裝置可能產生的電磁干擾。

  d.  光學元件採用高穿透率石英玻璃材質( UV可通過 )。

  e.  顯微鏡基座內建12V/100W鹵素燈源，目鏡一對10x，FOV=25mm。

   f.   6孔電動鏡頭鼻輪，縱深精確度優於100 nm。

  g.  三眼觀察鏡筒，分光：100-0/50-50/0-100%。

  h.   6孔旋轉聚光鏡，工作距離28mm以上。

   i.   4孔電動旋轉干涉對比(DIC)用菱鏡轉盤。

   j.   6孔電動旋轉螢光濾鏡組，含100W汞燈及電源供應器。

  k.   3組螢光濾鏡組，供UV、Blue、Green激發光使用。

   l.   電動干涉對比模組 ( 4-pos. disc, polarizer, analyzer,, objective prism, condenser prism )

 m.  電動掃描式載物台，可由共軛焦軟體直接控制。

 

V. 共軛焦專用高解析物鏡組

  a.   HC PL APO 10x/0.40 PH1, WD=2.2mm, UV/405nm雷射適用。

  b.   HC PL APO20x/0.70 PH2, WD=0.59mm, UV/405nm雷射適用。

  c.   HCX PL APO 40x/1.25 PH3 Oil, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用。

  d.   HCX PL APO 63x/1.40-0.60 Oil,CS lb blue, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用。

  e.   HCX PL FLUOTAR L 40x/0.60 PH3 CORR, WD=3.3-1.9mm。

  f.    所有物鏡皆可進行DIC觀察

 

VI. 多重雷射系統 ( 405nm-Vis )與AOTF控制系統

  a.   雷射系統I: 100mW Ar-Blue Laser, 458nm, 476nm, 488nm, 496nm, 514nm。

  b.   雷射系統II: 10mW yellow DPSS laser, 561nm。

  c.   雷射系統III: 10mW HeNe Red Laser , 633 nm。

  d.   AOTF光纖傳導，可同時控制8組可見光雷射波段與強度。

 

  a.  50 mW氣冷式405nm diode laser

 

   所有物鏡(10x, 20x, 40x, 63x oil)均有紫外光(或405nm)校正孔徑聚光鏡。

 

VII. 高靈敏度螢光感應器(HyD)

 

VIII. 活細胞培養裝置

 

 

 

  1.   共軛焦掃描器內可最多同時執行5組入射光(螢光)分光光譜掃描感測器(5 channel spectrophotometer detectors )。每一個螢光感測器（PMT）都可獨立依據各個螢光染劑的感測光譜自行設定擷取範圍而無任何傳統濾鏡限制( filterless design )，連續感測光譜可調範圍為400 – 800 nm。本次規格掃描器內含3組感測器(PMT)及1組穿透光感測器，除同時掃描外亦可進行排序掃描( sequential scanning )。

  2.   使用單一稜鏡分光光譜模式偵測，非傳統Grating分光模式。每組螢光偵測器均使用可調控光柵控制螢光接收範圍，亦可以數值輸入設定，最小解析達1 nm。

  3.   螢光感測器(PMT )採用水冷式cooling設計，可有效降低雜訊，提高訊噪比（S/N ratio）。

  4.   掃描器可切換安裝使用於正立與倒立顯微鏡，無須再作任何光路與控制調整。

  5.   3組獨立的雷射光纖導光口，供紫外光雷射(或405nm)、可視光雷射與紅外光雷射同時傳導。完全以AOTF作為激發光波長選取與雷射強度控制，為UV(or 405 nm)-VIS-IR皆通用之共軛焦系統。

  6.   共軛焦分光光譜掃描光路具有單一共軛焦感測孔徑(Pinhole)，微電腦控制，孔徑可調( max. 600um )。

  7.   高解析傳統掃描模式規格：
            Max. line frequency : 2800 Hz
            Min. line frequency : 1 Hz
            Max. frame rate at 512 x 512: 5 f/s
            Max. frame rate 512 x 16: 50 f/s
            Scan zoom: 1 – 64x

  8.   高解析傳統掃描模式之解析最高可達 8192 x 8192 x 16 bits灰階影像，數位化12 bits或8 bits per channel，掃描視野大小可達中間影像對角線21 mm以上。

  9.   光學動態旋轉掃描範圍: 200度。

  10.  可對任何所選用的鏡頭自動選取紫外光(或405nm)校正孔徑稜鏡( UV correction Pinhole Lens )

  11.  可控制兩組縱深光切掃描載物檯 ( Galvanometer Z-stage及Microscope E-Stage或Microscope nosepiece )。

  12.  具有PMT靈敏度補正設計，可依需求於Z軸掃瞄時同時補正PMT的電壓，以維持3D掃瞄時每一張影像螢光強度的穩定。

  13.  Galvanometer Z-stage，縱深精確度優於3 nm，行程1500um。

  14.  所有之調控參數均可由panel box調控，且panel box具有LCD顯示功能。

  15.  具有Best focus與auto gain設計。

 

    1.  以專利之超音波光學調變裝置篩選激發與釋放波長,激發波長篩選精度達2 nm，無傳統分光濾鏡組。

    2.  最多可同時分光八組雷射激發光源。

    3.  可程式控制八組雷射激發光源之強度與分光比例。

 

    1.   雷射系統I: 65mW Ar-Blue Laser, 458nm, 476nm, 488nm, 514nmW

    2.   雷射系統II: 1mW HeNe Green laser, 543nm.

    3.   雷射系統III: 2mW HeNe Orange laser, 594nm.

    4.   雷射系統III: 10mW HeNe Red Laser , 633 nm.

    5.   AOTF光纖傳導,可同時控制8 組可見光雷射波段.

    6.   50 mW氣冷式405nm diode laser。

    7.   物鏡(10x, 20x, 40x, 63x oil)均有405nm校正孔徑聚光鏡。

 

    1.   系統工作站Pentium IV DUO 2,13GHz，4G MB以上DDR記憶體，2 組 19” LCD顯示器。

    2.   系統電路控制器，可同時操控5組感測系統。

    3.   掃描器控制設計採用 FRGA ( Field-Programmable Gate Array )。

    4.   訊號出入 ( Trigger IN / OUT )可同時操控8組感測器 ( Detectors )，12 bits解析。

    5.   系統軟體Windows XP Pro。

    6.   標準系統軟體部分( System software)：
               Continuous Scan
               Single Image Scan ( for light sensitive experiments )
               Image Series Scan
               AOTF used to minimize specimen bleaching
               Dye based pre-sets to control scans (Instrument Settings)
               Scan-Parameters are attached to image for later reconstruction.
               Unidirectional & phase corrected Bi-directional Scans
               13 scanning mode: t, xt, xλ, xyt, xyλ, xz, xzλ, xyz, xyzλ, xyt, xzt, xyzt, xytz Region of interest scan
               Excitation Multiplexing
               Frame Average
               Line Average

  7.  應用軟體部份( Application software)：
               Time-lapse Recording - Observation of dynamic processes by
               xt series
               xyt series
               xyzt series ( Time/Volumes series scan )
               Sequential Scan - Change of Instrument settings
               Volume by volume, Frame by frame, or Line by Line for Cross-Talk elimination
               3D projection and animation
               FRAP, FREP application
               Dye finder function

 

  1.   全自動倒立式螢光顯微鏡，內置共軛焦掃描專用光路控制器，可直接銜接共軛焦掃描器，且螢光模式與共軛焦掃描模式為電動切換，可由共軛焦軟體直接控制。

  2.   無線遠光學修正系統設計與光學平衡對比修正設計- Harmonic Contrast System。

  3.   採用外掛式電動控制系統，遠離電控裝置可能產生的電磁干擾。

  4.   光學元件採用高穿透率石英玻璃材質( UV可通過 )。

  5.   顯微鏡基座內建12V/100W鹵素燈源，目鏡一對10x，FOV=25mm。

  6.   6孔電動鏡頭鼻輪，縱深精確度優於15 nm。

  7.   6孔旋轉聚光鏡，工作距離28mm以上。

  8.   4孔電動旋轉干涉對比(DIC)用菱鏡轉盤。

  9.   6孔電動旋轉螢光濾鏡組， HBO100W汞燈光源。

  10.  3組螢光濾鏡組，供UV、Blue、Green激發光使用。

  11.  電動干涉對比模組 ( 4-pos. disc, polarizer, analyzer,, objective prism, condenser prism )。

 

  1.   HC PL APO 10x/0.40 CS, WD=2.2mm, UV/405nm雷射適用

  2.   HC PL APO 20x/0.70, WD=0.59mm, UV/405nm雷射適用

  3.   HCX PL-APO 40x/1.25-0.75 Oil CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用

  4.   HCX PL APO 63x/1.40-0.60 Oil,CS, WD=0.1mm, UV/405nm雷射適用

 

  1.   本裝置需直接架設在共軛焦顯微鏡上使用。

  2.   專用恆溫加熱載物台，可維持樣本培養溫度的恆定，可放置一般玻片或35-58mm培養皿以及slide chamber等。

  3.   數位式精確溫度控制器，具雙控制感應裝置與溫度數據顯示，並設有迴路感應裝置，以達到全系統恆定狀態。

  4.   二氧化碳濃度控制器，可精確維持培養器內二氧化碳的濃度，以維持細胞培養的酸鹼值恆定。二氧化碳的濃度控制範圍為0%-20%。與上述溫度控制器結合後，成為完整的活細胞酸鹼值恆定與恆溫控制系統。

  5.   二氧化碳偵測器為NDIR設計。

  6.   可將100%氧氣鋼瓶輸出之氧氣自動混合成不同比例之氧氣混合氣體，混合範圍0.1-20%或廣於。

三、新式系統【Leica TCS SP5 II】與舊式系統【Leica TCS SP5】主要不同如下：

 

由於配備的差異，新式系統【Leica TCS SP5 II】可額外提供活細胞培養觀察（需由專人操作，只開放上班時段服務。）、細胞定位多點擷取以及大範圍影像擷取拼接等功能。另外，HeNe Orange 594nm對Alex 594, Texas Red, Mito Tracker, Orange/Red …等染劑可以有較好的激發能力，提供更加的影像結果。因此，若有上述功能需求，請預約新式系統SP5 II。另外，若有活細胞培養需求，請事先與管理者聯絡，方便架設系統。

 

 

四、參考資料