ABI7900 簡介
 

簡介   操作方式
簡介

ABI PRISM 7900可應用於基因定量(例如:癌症基因與免疫基因的定量、病原菌偵測、miRNA基因調控研究等)與基因型定性研究(例如:SNP與疾病關聯性等)。

基因定量的原理為同步定量PCR (Real-time quantitative PCR),即在進行PCR時同步偵測PCR產物隨著反應增加的狀況,再利用所偵測到的產物量回推樣品中原始基因之表現量。螢光標定的方式則有TaqMan、TaqMan MGB、SYBR green I等三種。上機盤式有96孔盤及384孔盤兩種,可依檢體數目來選擇。

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操作方式

I. 簡易上機操作步驟

  1. 先開電腦,待開機後再將7900HT的電源打開。
  2. 開啟SDS 軟體:按兩下電腦螢幕上7900軟體的icon。
  3. 當軟體開啟之後會出現視窗,視窗下方為狀態顯示列。此時右下顯示Disconnected。
  4. 從」 File」下選擇」 New」後會出現一視窗如下:

    Assay依實驗設計選擇:

    Assay

    Applications

    When to use this

    Absolute Quantification (Standard Curve)

    絕對定量

    建立標準曲線以得知樣品之基因表現量(For data collection and data analysis)。

    Relative Quantification (△△CT)

    相對定量

    以Ct差異代表基因表現量相差之倍數(上機for data collection)。

    Relative Quantification (△△CT) study

    相對定量

    以Ct差異代表基因表現量相差之倍數(For data analysis: analyze data from relative quantification £10 plates)。

    Allelic Discrimination

    SNP genotyping

    For Post read PCR signal and SNP genotyping analysis

    Container 選擇適當的Plate,384-或96- well Plate。

    Template 點選已設好的Template;若無,則選擇」Blank Template」。

  5. 在輸入適當參數後,按OK即出現一Plate Document如下圖:

  6. 按下Add Detector,開始設定Detectors(Detectors 代表樣品的螢光種類),選擇此次所需的Detector,並按下Copy to Plate Document將Detector加入Plate Document後則可按下Done。

    如要設定新的Detector ,則可在Detector Manager中按下New選項以設定新的Detector:

  • Name:代表基因名稱。
  • Description:可輸入簡短敘述最多32個字母。
  • Reporter:依實際所使用的螢光種類選擇。
  • Quencher:若為一般的TaqMan Probe選擇TAMRA。若為MGB Probe或SYBR Green I 則選」None Fluorescent」。

按 」OK」。

重複以上步驟設定新的Detectors。

設定完成後,點選」Copy to Plate Document」。之後,選Done,所設定的Detector即會加入Plate Document中。

  1. 圈選Plate Grid中有放樣品的well,在Set Up視窗下選定適當的Detector,然後點選Detector列中Use的框框,並在Task欄中選擇其種類:

Absolute Quantification: 「NTC「, 「Unknown「, 「Standard」,若選擇standard 則須輸入樣品量。

  • Relative Quantification: 「Target」 或 「Endogenous control」 。
  • Allelic Discrimination: 「Unknown「 或 「NTC「 。

  1. 如要輸入樣品名稱,可在Set Up此視窗編輯樣品名稱(相同名稱者,軟體即視為重複樣品,會自動計算平均值及標準偏差)。
  2. 點選Instrument以設定PCR條件:進入PCR設定之視窗後,可直接更改溫度及時間,已可利用」Add Cycle」、」Add Hold」、」Add Step」改變PCR的條件。

    註:若樣品為SYBR的反應請點選Add Dissociation Stage。
     

  3. 所有參數都設定完成後,須先將Plate Document存檔:File menu下點選Save As,輸入檔案名稱, File of type點選ABI PRISM SDS Single Plate (*.sds)。

    註:若此Plate Document常用,可將其存成」Template」: File menu下點選Save As,輸入檔案名稱, File of type點選SDS Template (*.sdt) 格式。

  4. 在Plate Document中,點選」Instrument」 tab,按下Open/ Close按鍵將Instrument Tray從機器送出,將Plate放在Tray上方後,再按一次Open/ Close將Plate送入7900 。

                                                    Open/ Close


    將樣品盤置入方向如下:

  5. 按」 Start」即開始進行PCR及訊號收集。

 

II. Absolute Quantification 結果分析

  1. 當訊號收集完成請先確認Analysis Setting中Threshold及Baseline的設定如下圖:

    可選擇 」Automatic Ct 」由軟體來設定Threshold 及Baseline ;

    或可經 「Manual Ct」來決定Threshold 及Baseline 。

  2. 按下螢幕上綠色的箭號即開始進行分析,完成後如下圖:

  3. 上圖為Amplification Plot。欲更改縱座標的顯示單位,請在縱座標處點兩下即可進行更改。欲更改Threshold,請將Y軸改成Log以方便找到Geometric phase。

  4. 欲觀察不同形式的結果請點選螢幕上的功能鍵。

    由左至右依序為:

  • System Raw Data Pane
  • Multicomponented Data Pane
  • Amplification Plot Pane
  • Standard Curve Pane
  • Dissociation Curve

    如下圖:

  1. 若分析的是SYBR Green I的data請檢查Dissociation Curve中是否有non-specific產物產生。正確結果應如如下圖:

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公告日:2011/04/01





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