常見問題
 

一、 以 Big Dye 為 DNA 定序反應對那些 DNA 序列無法解決?
二、 利用 miniprep 抽 plasmid 做 DNA 定序要注意那些事項?
三、 利用 PCR product 做 DNA 定序要注意那些事項?
四、 PCR product如何用酵素純化
五、 定序的 DNA 量需要多少?
六、 Primer 設計要注意什麼?
七、 送件需要多少 primer 的量?
八、 為什麼PCR可以反應但是在定序卻做不出來?
九、 定序反應中反應弱的標準為何?
十、 DNA 定序反應失敗的原因?
十一、 如何從個人電腦看Sequencing data?
十二、 如何從個人電腦看片段分析的peak?

一、 以Big Dye為DNA定序反應對那些DNA序列無法解決?
Ans:
1.

poly A、poly T、poly C、poly G。

poly A及poly T base>10 在 PCR產物做DNA序無法讀過
poly A及poly T base<25 可以接在plasmid就可以讀過
 

2. GT、GA、AT、CT等repeat sequence。
3. GC rich與2級結構 的序列要另做特殊處理與一般反應條件不同,要分開做反應。
4. 類似GTGT,GGGGAGGA,GGGGTGGT等序列。
二、 利用 miniprep 抽 plasmid 做 DNA 定序要注意那些事項?
Ans:
1. 在wash solution洗後要elute前,請先空轉3-5分鐘去除酒精殘留。
2. 請用熱水elute,溫度最好超過70℃。
3. 殘留alcohol、salt、EDTA、detergent、organic chemicals會干擾Big Dye反應。
三、 利用 PCR product 做 DNA 定序要注意那些事項?
Ans:
1. PCR product一定要是single band,不可以smear。
2. 不能有loading dye殘留。
3. PCR product定序前要先去除primer和dNTP。
4. 只能加一個primer。
5. 利用gel elute PCR product時,避免用短波UV照射,gel elute PCR product反應會較弱。
四、 PCR product如何用酵素純化
Ans:
1. 使用Exonuclease I去除primer和Shrimp Alkaline Phosphatase(SAP)去除dNTP。
2. 必須是single band。
五、 定序的 DNA 量需要多少?
Ans:
PCR product:
以一般體積10ul反應30 cycle為例
電泳凝膠圖使用PCR products 2μl 與100bp DNA ladder Marker 2μl中
的500bp片段比較亮度,亮度需強過Marker。
PCR 200-500bp 約取3~4 μl
PCR 500-1000bp 約取5~7 μl
Plasmid:
Plasmid<15 kb 60-100ng/ul 總體積8ul
 
六、 Primer 設計要注意什麼?
Ans:
1. Primer > 18 bp。
2. Tm 值 : 45℃-55℃;正常反應 annealing 在 50℃。
3. 避免自黏或形成二級構造。
七、 送件需要多少 primer 的量?
Ans: 120-150ng,如與插入2-3Kp Plasmid DNA比較約1:5
八、 為什麼PCR可以反應但是在定序卻做不出來?
Ans: 因為一般PCR的extension的溫度在72℃,而在定序反應的extension的溫度在60℃。所以,在定序反應時,Tm 值最好在45℃-55℃。
九、 定序反應中反應弱的標準為何?
Ans: 以電腦分析的raw data為準,除遇到特殊序列外,在X軸12000的位置其Y軸的高度沒有200者皆屬於反應弱。即可讀長度低於550bp。
十、 DNA 定序反應失敗的原因?
Ans:
1.

Sequencing reaction失敗(全黑gel image)

a.DNA template品質不好,檢查方式如下:

  • DNA的鹽濃度過高
  • DNA內含蛋白質
  • DNA有殘留有機化合物,如phenol, chloroform, ethanol等
  • DNA有殘留EDTA、detergents等
  • DNA 壞掉
  • 菌液直接做sequencing

b.Primer 方面

  • 未加primer
  • 加錯primer
  • primer壞掉
  • primer設計錯誤
  • vector 的primer binding site 壞了
2.

Sequencing reaction不完全(有微弱反應)

a. DNA template品質不好,檢查方式如下:

  • DNA的鹽濃度過高
  • DNA內含蛋白質
  • DNA有殘留有機化合物,如phenol , chloroform , ethanol等
  • DNA有殘留EDTA、detergents等
  • DNA量太少
  • DNA 壞掉
  • DNA 照過短波UV

b. Primer 方面:

  • Primer 設計錯誤,有1-2個bases 錯誤或是Tm值 <45℃ 
  • Primer壞掉 
  • Primer自黏或形成二級構造 
  • Primer過多(>16 pmole) 
  • vector 的primer binding site 壞了

c.遇到特殊構造,如GC-rich, poly-A,T,CA,GA,CT,GT重複序列
 

3.

Sequencing reaction 正常,但出現污染現象

a.DNA template方面

  • PCR 產物做DNA template時,有殘留 dNTP 及primer
  • 有RNA汙染
  • 有chromosomal DNA汙染
  • Plasmid存有兩種不同clone
  • PCR 產物有多於一個以上的bands
  • DNA template太短

b.Primer 方面

  • 同時存在二個primers
  • Primer 設計錯誤,有1-2個bases 錯誤或是Tm 值 < 45 ℃
  • DNA binding site有兩個以上
  • Primer品質不佳base有長短不一樣

c.遇到特殊構造,如GC- rich, poly- A,T, CA,GA,CT,GT重複序列

d.反應太強

十一、 如何從個人電腦看Sequencing data?
Ans:
1. 早期電腦可下載Chromas (Windows)或是Edit View (Mac)軟體。
2. 另可至 Geospiza 網站下載最新免費軟體 FinchTV (for Mac OS X, Windows, Linux, Solaris)。
3. 可至原廠下載sequence scanner軟體。如果需要sequence scanner軟體可以至本單位拷貝。
十二、 如何從個人電腦看片段分析的peak?
Ans: 可至原廠下載Peak scanner軟體。如果需要Peak scanner軟體可以至本單位拷貝。

 

公告日:2011/05/11





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